A könyvtárban található a világ egyik legkitűnőbb, iniciálékkal ellátott kéziratokból álló gyűjteménye. A felújítási munkálatok során többek között a katalógusrendszert és a biztonsági rendszert korszerűsítették.

Az Apostoli Könyvtárat V. Miklós pápa alapította az 1450-es években, hogy 350 latin nyelvű kézirat elhelyezését biztosítsa. A pápa halálakor, 1455-ben a gyűjtemény már 1500 kódexet számlált, és ezzel Európában egyedülálló volt.

A vatikáni könyvtár manapság mintegy 65 ezer kéziratot őriz, köztük a B kódexet, a legkorábbi ismert teljes Bibliát. A feltételezések szerint a 325-ből származó Biblia egyike annak az ötven kézzel másolt példánynak, amely Nagy Konstantin császár megrendelésére készült.